Regulatory mechanisms of KLK proteases from prostate

    Projektdetails

    Beschreibung

    Gewebskallikreine (KLKs) sind (chymo)trypsin-artige Serinproteasen. KLK2, 3, 4 und 11 werden vorwiegend in Prostata exprimiert und in die Prostataflüssigkeit abgegeben, wo sie aus inaktiven Zymogenen in aktive Proteasen umgewandelt werden. KLK3 (PSA) spaltet gelbildende Proteine in der Samenflüssigkeit und dient als bester klinischer Marker für die Diagnose von Prostatakrebs. Aktivierung und Regulation der proteolytischen Aktivität der KLKs aus Prostata stehen im Zentrum unseres Projekts. Zu diesem Zweck werden enzymkinetische Parameter in Abhängigkeit von Regulatoren wie Zn2+ oder Ca2+, der Glykosylierung, sowie von Inhibitoren gemessen. Diese Ergebnisse werden durch Mutationsanalyse und röntgenkristallographische Strukturbestimmungen untermauert. Die Oligomerenbildung von KLK3 und 4 könnte ein wesentliches regulatorisches Prinzip darstellen und wird ebenfalls untersucht. Parallel dazu wird im Rahmen unseres D-A-CH-Projekts die Regulation der KLK-Aktivität durch Funktionsstudien in stabil transfizierten humanen Prostatakarzinomzellen erforscht. Schließlich erwarten wir, durch Überexpression und Modulation der KLK-Aktivität in Tiermodellen das „Prostatakrebs-Aktivom“ zu skizzieren. So identifizierte Targets können der Entwicklung neuer Therapiekonzepte zur Behandlung von Prostatakrebs dienen, wobei entsprechende Kristallstrukturen eine Voraussetzung für das rationale Design von Inhibitorverbindungen als zukünftige Pharmazeutika sind.

    In unserem struktubiologischen Labor in Salzburg werden molekularbiologische, biochemische, biophysikalische und röntgenkristallographische Methoden angewendet. Das Gesamtprojekt im Rahmen des D-A-CH-Programms beinhaltet eine Kooperation mit einer Arbeitsgruppe an der TU München, die vorwiegend molekularbiologisch und zellbiologisch arbeitet. Weitere biophysikalische Methoden, die in Kooperation mit anderen Forschungsgruppen zum Einsatz kommen können, wären die analytische Ultrazentrifugation und Röntgenkleinwinkelstreuung (SAXS). Nachfolgend sind die Methodenpakete des gesamten Prokekts aufgeführt.

    (M1) Klonierung, Expression und Reinigung der KLK-Proteine

    (M2) Enzymatische Charakterisierung, einschließlich der Bestimmung kinetischer Parameter

    (M3) Biophysikalische Charakterisierung: Gelfiltration, Dynamische Lichtstreuung, Mikrokalorimetrie und CD-Spektroskopie

    (M4) Kristallisation und Strukturbestimmung

    (M5) Überexpression von KLK2, 3, 4 und 11 in stabil transfizierten Prostatakarzinomzellen
    StatusAbgeschlossen
    Tatsächlicher Beginn/ -es Ende17/01/1116/05/15

    Systematik der Wissenschaftszweige 2012 (6-Steller)

    • 106041 Strukturbiologie
    • 106002 Biochemie
    • 106023 Molekularbiologie

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    • 106 Biologie