Structures of KLK protease substrate transition states

    Projektdetails

    Beschreibung

    Kallikrein-Peptidasen (KLKs) sind 15 chymotrypsinartige Serinproteasen, die in fast allen Geweben des Menschen sekretiert werden. Einige KLKs sind für die Befruchtung und Hautschuppung erforderlich und an Prostatakrebs oder Neurodermitis beteiligt. Für die KLKs 1 bis 8 und KLK10 sind Kristalle bekannt. Als erste Stufe des Projekts werden rekombinante KLKs gereinigt, kristallisiert und mit Substratanaloga versetzt, um Komplexe zu bilden, welche nicht-kovalente Enzym-Substrat-Übergangszustände (ÜZ), tetraedrische ÜZ oder Acyl-Intermediate darstellen. Zur Stabilisierung kurzlebiger ÜZ können inaktive Ser195Ala-Mutanten mit Peptiden oder auch nicht spaltbare Analoga der Peptidbindung eingesetzt werden. Tetraedrische ÜZ können durch Difluoromethylenketone und Acylzwischenprodukte können durch Aldehyd- und Borsäure-Peptide imitiert werden. Labile Komplexe können durch Disulfidverbrückung von KLK-Cys-Mutanten und Cys-haltigen Peptiden stabilisiert werden. In der zweiten Projektphase wird die Komplexbildung aktiver KLKs mit natürlichen Substraten angestrebt, z.B. KLK-Proformen, Semenogeline und corneodesmosomale Proteine, oder LEKTI-Inhibitoren. Modifizierte Substratfragmente können chemisch ligiert werden, um stabile KLK-ÜZ-Komplexe zu erhalten. Idealerweise sollte eine Serie aller ÜZ-Analoga mit einem Vollängesubstrat erzeugt werden.

    Im strukturbiologischen Labor in Salzburg werden molekularbiologische, biochemische, biophysikalische und röntgenkristallographische Methoden angewendet. Das Projekt beinhaltet auch eine Kooperation mit Arbeitsgruppe für bioorganische Chemie von Prof. Chiara Cabrele. Gegebenenfalls können weitere molekularbiologische, zellbiologische und biophysikalische Methoden in Kooperation mit weiteren Forschungsgruppen (z.B. Viktor Magdolen, TU München) zum Einsatz kommen.

    (M1) Expression und Reinigung der KLK-Proteasen

    (M2) Enzymkinetische Messungen der KLK-Aktivität und von Inhibitionsparametern

    (M3) Präparation von KLK-Substrat- und Inhibitorkomplexen

    (M4) Biophysikalische Charakterisierung: Gelfiltration, Dynamische Lichtstreuung, Mikrokalorimetrie

    (M5) Kristallisation und Strukturbestimmung
    KurztitelStructures of KLK transition states
    StatusAbgeschlossen
    Tatsächlicher Beginn/ -es Ende1/08/1231/07/16

    Systematik der Wissenschaftszweige 2012

    • 106 Biologie

    Systematik der Wissenschaftszweige 2012 (6-Steller)

    • 106041 Strukturbiologie
    • 106002 Biochemie
    • 106023 Molekularbiologie

    Systematik der Wissenschaftszweige 2002

    • 1451 Strukturbiologie
    • 1411 Molekularbiologie
    • 1402 Biochemie